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DH5α 感受态细胞
点击次数:42 发布时间:2020-02-11

DH5α 感受态细胞

 

 


储存条件:-70℃保存,避免反复冻融。

 

组成 YBC102-01 BC102-02

DH5α Competent cells 10×100µl 20×100µl pUC190.1ng/µl 5µl 5µl

产品介绍:

本公司生产的 DH5α感受态细胞是采用大肠杆菌 DH5α菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞,可用于

DNA 的化学转化。使用 pUC19 质粒检测,转化效率可达 108 cfu/µg-70℃保存几个月转化效率不发生改变。每支感受态可以酌情分装使用,降低了实验的成本。质量稳定,使用方便,质优价廉。

基因型:

 

F-φ80 lac ZΔM15 Δ(lacZYA-arg F) U169 endA1 recA1 hsdR17(rk-,mk+) supE44λ- thi -1 gyrA96 relA1 phoA

 

产品特点:

一种用于铺制与培养质粒平板和粘粒平板的重级缺陷的抑制型株。其φ80 lacZΔM15  基因的产物可与 pUC

载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α互补,可用于蓝白斑筛选。操作步骤(以下操作均按无菌条件的标准进行):

提示

感受态细胞应保存在-70℃,不可多次冻融和放置时间过长,以避免降低感受态细胞的转化效率。

进行转化操作时,应根据相应温度及无菌条件的要求进行。

为防止转化实验不成功,可以保留部分连接反应液,以重新转化,将损失降到最低。

1. 取感受态细胞置于冰浴中,如需分装可将刚融化细胞悬液分装到无菌预冷的离心管中,置于冰浴中。

(一次转化感受态细胞的建议用量为 50-100μl,可以根据实际情况分装使用。应注意所用DNA 体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一。以下实验以 100μl 感受态细胞为例。)

2. 向感受态细胞悬液中加入目的 DNA  ,轻轻旋转离心管以混匀内容物,在冰浴中静置 30 分钟。

  • 将离心管置于 42℃水浴中放置 60 秒,然后快速将管转移到冰浴中,使细胞冷却 2 分钟,该过程不要摇动离心管。此步骤也可将离心管置于室温进行,时间不需十分准确,夏季或室温较高时,可放置 5-8 分钟左右;如果室温较低,可延长时间至 8-15 分钟左右。条件允许建议使用 42℃热激方法。)

 

4. 向每个离心管中加入 500μl 无菌的 SOC LB 培养基(不含抗生素,混匀后置于 37150rpm,摇床振荡培养 60 分钟,目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达,使菌体复苏。

5. 无菌条件下,取适量菌液加到含相应抗生素的 LB 固体培养基平板上,用无菌的细菌涂布器或玻璃珠将细胞均匀涂开。等平板中的液体完全吸收后,倒置平板,37℃培养 12-16 小时。(涂布用量可根据具体实验来调整。转化质粒在 10ng 左右,90mm 平皿涂布 100µl55mm 平皿涂布 50µl;连接产物的转化菌液建议离心后倒掉大部分上清,余 200µl,取 100µl 用于涂布。)

6. 保留剩余的菌液于 4℃冰箱中,视平板上菌落生长情况决定去留。

质粒快速转化步骤:将步骤 2 的时间缩短到 5 分钟,对于氨苄青霉素抗性的质粒,步骤 3 完成后,可直接涂布或划线于含氨苄青霉素抗性的LB 平板上。其它抗性的质粒仍需 60 分钟的复苏培养。)

相关试剂及培养基的制备方法:

 

LB 液体培养基:称取 10gTryptone5g Yeast Extract 10g NaCl 置于 1L 烧杯中。加入约 800ml 的去离子水,完全溶解后用 2mol/L NaOH 溶液调节 pH 值至 7.0。加去离子水定容至 1L。分装后,121高压灭菌 20 分钟。

2. SOB SOC 培养基:称取 20g Tryptone5g Yeast Extract0.5g NaCl 置于 1L 烧杯中加入约 800ml 的去离子水,完全溶解后再补加 10ml 250mM KCl 溶液,滴加 5M NaOH0.2mlpH 7.0。加入去离子水将培养基定容至 1L121℃灭菌 20 分钟。使用时加入 5ml 灭菌的 2M MgCl2 (此种培养基称为SOB。再补加经 0.22um 过滤除菌的 1M 葡萄糖溶液 2ml此种培养基为 SOC)。

3. 转化复苏细菌用的液体 LB 培养基或SOC 培养基:可以一次高压 50ml 液体培养基,无菌状态按 1ml 每管分装于高压灭菌的 1.5ml 离心管中,装于自封袋中,冻存于-20℃中,每次用一支。可以极大地避免培养基污染和减少劳动量。

4. LB 固体选择培养基:100ml LB 液体培养基中加入 1.5g 琼脂粉,摇匀后,121℃高压灭菌 20 分钟。冷却至 50℃左右时加入相应浓度的抗生素(AMP 浓度通常为 100ug/ml),混匀后倒在细菌用的无菌养皿中,等琼脂凝固后即可使用。

5. IPTG:称量 1.9g IPTGMW=238.31充分溶解于 40 ml 灭菌水,浓度为 200mmol/L。用无菌 0.22μm

过滤膜过滤除菌。小份分装后,-20℃保存。

6. X-gal:用DMF(二甲基甲酰胺)配制成 20mg/ml,小份分装(1ml/份)后,-20℃避光保存

高纯度质粒小量快速提取试剂盒

PCR 产物纯化回收试剂盒说明

 

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